domingo, 11 de octubre de 2009

COMO DEMOSTRAR ABUSO SEXUAL INFANTIL POR ADN

 
ESTUDIOS DE ADN
Bioq. OSCAR ANGEL CRESPO
PERITO BIOQUÍMICO – ACORDADA SUPREMA CORTE DE JUSTICIA
ESPECIALISTA EN GENÉTICA - BIOTECNOLOGÍAS
 
 
ADN NUCLEAR

La información genética codificada en el ADN nuclear humano (genoma), está contenida en unos tres millones de pares de bases (bp), que corresponden a solo el 20% del genoma que es de aproximadamente  100.000 genes funcionales.
El 80% restante se denomina ADN extragénico y contiene las secuencias altamente repetitivas en tandem: los minisatélites y microsatélites de ADN. Dichas regiones son hipervariables.

Los minisatélites son regiones, con una secuencia llamada core, de unos 15-30 bp que se repite un determinado número de veces. El número de veces que esa secuencia core se repite es la base del polimorfismo del sistema.
Para un minisatélite o sistema dado, las distintas variantes se denominan alelos.

Los microsatélites, al igual que los minisatélites, son polimorfismos de repetición.
Los microsatélites, poseen polimorfismos de repetición. La unidad de repetición es de 2-4 bp. En este grupo encontramos a los STR: repeticiones en tandem cortas (Short Tandem Repeats). Los STR tetraméricos (cuatro pares de bases repetidas) tienen mucha fidelidad y especificidad en la reacción de ampliación, por lo que son de elección en el campo de la identificación humana.
La metodología para ponerlos en evidencia es el Southern-Blott, que utiliza la reacción en cadena de la polimerasa (PCR o reacción de ampliación) y posterior detección por diversas técnicas bioquímicas automatizadas

Entre las ventajas de uso de los sistemas STR podemos citar:

Se puede analizar menor cantidad de ADN, ya que amplifican el genoma. Esta es una ventaja ya que consumen poca muestra.
Análisis de muestras degradadas.Automatización del proceso.
Baja tasa de mutación: para análisis de identificación o paternidad, la tasa de mutación de los marcadores debe ser extremadamente baja para evitar la falsa exclusión.

ADN MITOCONDRIAL

El ADN mitocondrial es de herencia materna, permitiéndonos definir lo que llamamos linaje materno y es muy útil para el análisis de la evolución humana.
Dado el elevado número de moléculas de ADN mitocondrial por célula, el riesgo de degradación respecto al ADN nuclear es menor. Es por lo tanto muy útil para estudiar restos óseos muy antiguos.

A partir del estudio del ADN mitocondrial se identificaron restos arqueológicos de cientos y hasta miles de años de antigüedad.

humana. Debido a la variabilidad, la REGIÓN CONTROL es la que normalmente se analiza. Esta región es la más interesante desde el punto de vista de la identificación 
humana.


Técnicamente se secuencian las regiones HPVI y HPVII y se las compara con la secuencia de Anderson.

CROMOSOMA Y

En los últimos años se incorporó al análisis de ADN el estudio del "cromosoma Y".
El sexo de una persona es definido por dos cromosomas: los varones tienen un cromosoma X y un Y, y las mujeres tienen dos cromosomas X.

El 60 % son secuencias polimórficas. Debido a la falta de un elemento homólogo, solo hay un cromosoma Y, la mayor parte de dicho cromosoma no recombina durante la meiosis (no intercambia material genético con otro cromosoma). Esto define la "herencia en bloque", característica de los STR de cromosoma Y.
Los polimorfismos presentes en el cromosoma Y son una herramienta adicional en el análisis de identificación humana.
El análisis del haplotipo es de gran utilidad en casos de crímenes violentos con abuso sexual, permitiendo la rápida diferenciación del ADN de la víctima y del victimario.
Son particularmente útiles también en casos de hermandad (entre varones).
El haplotipo del cromosoma Y, en hombres o niños, nos define el linaje paterno.
Son marcadores de Linaje y no de identidad.

Valoración de la prueba pericial de ADN
Cuando analizamos polimorfismos genéticos y tratamos de definir si corresponden a un individuo pueden darse dos situaciones:

a) que no coincidan varios de los marcadores analizados
b) que coincidan todos.
En el primer caso podemos establecer la no identidad, se trata de dos perfiles diferentes.
El problema se presenta cuando coinciden.Debemos considerar que siempre existirá incertidumbre sobre si el perfil corresponde al individuo, por lo tanto nunca podemos hablar de inclusión o certeza absoluta cuando no hay exclusión. Siempre debe hacerse una valoración estadística, basados en la probabilidad de encontrar dicho perfil en otro individuo de la población.
Para evaluar el valor de una prueba científica es necesario considerar al menos dos explicaciones para su ocurrencia. No debemos ver las cosas solo desde un punto de vista. La prueba se debe evaluar calculando las probabilidades bajo cada una de esas explicaciones alternativas.




La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
La PCR es una técnica poderosa usada para amplificar el ADN millones de veces, por la repetida réplica de una plantilla, en un corto período de tiempo.
El proceso utiliza sistemas de oligonucleótidos sintetizados in vitro específicos para preparar prime la síntesis de la ADN. El diseño de las sondas primers es dependiente de las secuencias de ADN que se desea estudiar.
La técnica se realiza durante muchos ciclos (generalmente 20 - 50) de derretir la plantilla de ADN a alta temperatura, permitiendo que los primers se alineen a las secuencias complementarias dentro de la plantilla de ADN y después permitiendo la replicación de la plantilla con la polimerasa de ADN.
El proceso se ha sido automatizado con el uso de polimerasas de ADN termoestables aisladas de bacterias que crecen en respiraderos termales en el océano o en fuentes de agua caliente. D
urante la primera ronda de replicación, una sola copia de ADN se convierte a dos copias y así sucesivamente dando por resultado un aumento exponencial en el número de copias de las secuencias blanco de los primers. Después de apenas 20 ciclos una sola copia de ADN se amplifica más de 2.000.000 de veces.



Evaluación de microsatélites:
Cada unidad de repetición de los microsatélites posee entre 2 y 5 nucleótidos, por lo cual se requiere la amplificación por PCR y evaluación posterior mediante geles de poliacrilamida (PAGE), similares a los empleados en secuenciación de ADN, que permiten discriminar diferencias de longitud de sólo un nucleótido.



Exclusión
Se utilizan 10/15 marcadores de locus, y como criterio de exclusión muestra/victimario se toma una discordancia igual o mayor que tres para descartar posibles mutaciones espontáneas al azar.
Una vez obtenidos los distintos valores se utiliza el siguiente criterio:
La probabilidad de inclusión 
La probabilidad de inclusión (PI) se calcula mediante la fórmula descrita por Essen-Möller, que desarrolla los aspectos bioestadisticos de las pruebas de inclusión y de paternidad, derivados del Teorema de Bayes.
 
La PI indica la probabilidad que tiene ese individuo de ser el proveedor biológico de la muestra pericial (X), comparado con un hombre al azar de la poblacion (Y).
Asi el valor de (X) depende exclusivamente del resultado de los análisis realizados a la muestra biológica, descartando el patrón de la víctima, y el valor de Y corresponde a la frecuencia en la población del alelo estudiado.
Generalmente se asume que la víctima y el presunto victimario no están relacionados.





Índice de inclusión
 
Indica cuantas veces es mayor la probabilidad del presunto acusado de ser el autor del hecho con respecto a un hombre tomado al azar.
 
IP = X/Y
 
X = Probabilidad del acusado
Y = Probabilidad de que lo sea un hombre al azar en la población de referencia.
 
La probabilidad que se toma para la inclusión, es de valores mayores al 99,75%



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